中温性と好熱性の両方の PET 加水分解酵素の特性を備えた PET 加水分解酵素の発見と合理的工学

Nature Communications volume 14、記事番号: 4556 (2023) この記事を引用

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ポリエチレンテレフタレート（PET）の廃棄物が多すぎると、さまざまな問題が発生します。 PET バイオリサイクルのための優れた PET 加水分解酵素の開発に焦点を当てた広範な研究が行われています。しかし、酵素工学で使用される鋳型酵素は主に、それぞれ中温性および好熱性の加水分解特性を示す IsPETase および葉枝堆肥クチナーゼに焦点を当てていました。ここでは、高い熱安定性と周囲温度で顕著な PET 分解活性を示す Cryptosporangium aurantiacum 由来の PET 加水分解酵素 (CaPETase) を報告します。我々は、他の PET 加水分解酵素と比較して、活性部位と基質結合溝を形成する残基で異なる骨格構造を示す CaPETase の結晶構造を明らかにしました。さらに、CaPETaseWTと比較して、Tmが83.2℃で、60℃でのPET加水分解活性が41.7倍向上した強力な熱安定性を示すCaPETaseM9バリアントを開発しました。 CaPETaseM9 は、pH スタットバイオリアクター内で 55 °C で半日以内に、透明および色の使用済み PET パウダーをほぼ完全に分解します。

プラスチックは合成ポリマーであり、耐薬品性、軽量、低コストという利点があります。これらは 1950 年代から世界中で広く使用されており、私たちの日常生活に不可欠なものとなっています 1,2。しかし、プラスチックは自然には分解しないため、何十億トンものプラスチック廃棄物が埋め立て地に捨てられ、海洋の廃棄島に漂い、マイクロプラスチックとして拡散し、深刻な地球規模の汚染を引き起こしています3、4、5、6、7。世界中の政府やプラスチック製造業者はこれらの問題を認識しており、プラスチック廃棄物の化学的および生物学的リサイクル戦略に焦点を当てた研究開発が近年加速しています8、9、10。

テレフタル酸 (TPA) とエチレングリコールの単位で構成されるポリエステルであるポリエチレンテレフタレート (PET) は、プラスチック包装材料として広く使用されており、リサイクルが比較的容易です。 PET の生物学的分解に関する研究は、過去 20 年間に活発に行われてきました 8、11、12、13。 PET バイオリサイクル技術には、微生物や酵素による PET の加水分解と高付加価値の化学物質への変換が含まれており、これにより最終的に PET の循環経済が確立されます 11、14、15、16。

現在までに、PET を加水分解できるさまざまな酵素が発見され、生化学的および構造的に特徴付けられています。特に、Ideonella sakaiensis 201-F6 由来の PETase (IsPETase) は、周囲温度で最も高い PET 加水分解活性を示し、PET 廃棄物処理に有望な酵素と考えられています 17。したがって、PET 加水分解効率と IsPETase の熱安定性を改善するために、現在さまざまな酵素工学研究が進行中であり、性能が向上した変異体が報告されています 18、19、20、21、22、23、24。最近、好熱性を示すメタゲノム由来の葉枝堆肥クチナーゼ (LCC) が発見されました 25。そのバリアントは、72 °C のバイオリアクターシステムで高い PET 解重合活性を示すことが示されており、生物学的 PET リサイクルの候補となっています 26。さらに、新たな PET 分解酵素の発見に向けた取り組みが進められており、Thermobifida fusca クチナーゼ (TfCut1,2)27、Thermomonospora curvata DSM43183 クチナーゼ (Tcur1278,0390)28、Bacterium HR29 (BhrPETase) など、さまざまな微生物や環境メタゲノム由来の酵素が発見されています。 )29、Fusarium solani pisi (FsCut)30、Humicola insolens (HiC)31,32、PET233、PET533、PET633、および PHL734 が報告されています。そして最近、バイオインフォマティクスにおけるゲノムマイニングによって耐熱性 PET 加水分解酵素が発見されました 35。

酵素による PET 加水分解の応用を実現するには、PET 加水分解酵素の本質的に高い触媒活性が出発点として重要な要素です。また、PET 材料のガラス転移温度付近での高温操作は PET の分解性能に有利であるため、好熱性 PET 加水分解酵素の特性を利用することも、優れた PET 加水分解酵素の開発にとって効率的な戦略です。したがって、触媒反応についての洞察を提供し、効率的な PET 生体触媒の範囲を拡大するには、高い触媒活性と高い熱安定性の両方を備えた有望な PET 分解酵素の発見が強く必要とされています。

40%) using I. sakaiensis PETase (Accession code: GAP38373.1) to query the model. Partial genes were removed from the retrieved sequences, and then sequences of the PETase candidates were randomly selected from the dataset. Multiple sequence alignment was performed using Clustal omega49. Phylogenetic reconstruction was performed via maximum likelihood (ML) using MEGA11 with the Dayhoff w/freq. model50,51. The tree with the highest log likelihood (−10401.10) is shown. Initial trees for heuristic search were obtained automatically by applying Neighbor-Join and BioNJ algorithms to a matrix of pairwise distances estimated using the JTT model, and then the topology with a superior log likelihood value was selected. Discrete gamma distribution was used to model evolutionary rate differences among sites (5 categories [+G, parameter = 1.6961]). The rate variation model allowed for some sites to be evolutionarily invariable ([+I], 4.28% sites). This analysis involved 27 amino acid sequences, and there was a total of 444 positions in the final dataset. Bootstrap values were obtained from 1000 replicates52. Sequence alignment of enzymes used in phylogenetic tree analysis was depicted as a graphical illustration using ESPript3 (Supplementary Fig. 1)53. Pairwise identity and similarity of the proteins were calculated using the Clustal omega method, and a sequence identity matrix was created using excel software./p>